3.1. PrimerDesigner

Polymerase Chain Reaction(PCR[1])에 사용할 프라이머(Primer)를 디자인 합니다.

특정 시퀀스에서 원하는 영역의 시퀀스를 PCR하기 위해서 프라이머[2]를 사용합니다. 이 때 원하는 부분(ORF영역, 전체길이 등등)을 PCR하기 위해서 필요한 프라이머를 만들어냅니다.. 뿐만 아니라 프라이머로 PCR후에 얻어지는 PCR product를 구합니다.

프라이머 디자이너(Primer Designer)를 사용하기 위해서는 시퀀스창에 시퀀스를 입력합니다. 시퀀스 입력 할 때 "Load Sequence" 버튼을 클릭하여 Sequence Loader를 이용하면 시퀀스 입력이 더 편합니다. 입력한 시퀀스가 일반 텍스트 시퀀스[3]인 경우에는 시퀀스창 아래 토폴로지(Topology) 선택 옵션을 이용하여 시퀀스의 토폴로지를 설정합니다.

"Linker Options"은 만들려고 하는 프라이머의 링커(Linker)부분을 입력하는 곳입니다. 링커는 프라이머에 사용자가 시퀀스 인식을 위해서 특별한 기능을 하는 시퀀스를 넣는 부분입니다. 일반적으로 DNA Cutter에서 사용하는 제한효소 사이트를 넣어줍니다.

"Design options"는 시퀀스에서 PCR을 통해 증폭시키고자 하는 부분을 설정합니다. 기본값은 "Full Length"이고 이는 시퀀스 전체를 증폭하는 프라이머를 만들어 냅니다. "From __ to __"는 사용자가 증폭하고자 하는 영역을 지정하는 옵션입니다. "Longest ORF"와 "Longest ORF including w/o start or stop codon" 옵션은 입력한 시퀀스에서 ORF를 검색하여 그 검색된 ORF 결과에서 가장 긴 CDS 영역을 증폭시키는 프라이머를 만드는 옵션입니다. 그러나 "Longest ORF including w/o start or stop codon" 옵션은 ORF를 검색할 때 시작 코돈(Codon)은 있으나 종료 코돈이 없는 것, 반대로 종료 코돈은 있으나 시작 코돈이 없는 것도 처음이나 마지막 부분에 시작, 종료 코돈이 있는 것으로 인정하여 ORF 검색결과에 포함시킨다는 점이 다릅니다.

"Length of annealing sequence determined by" 옵션은 프라이머가 PCR을 하기 위해서 시퀀스에 안정적으로 붙을(Annealing) 수 있는 조건을 설정하는 부분입니다.

"Tm value"로 설정하게 되면 a,t,g,c의 결합(Annealing) 능력[4]에 따라 시퀀스에 붙는 프라이머의 길이를 결정짓게 되고, bp로 설정하면 결합능력은 무시하고 시퀀스에 붙는 프라이머의 길이를 정하게 됩니다. 일반적으로 18bp이상의 값을 넣을 것을 추천합니다.

"Analysis options"의 "Check non-specific annealing Tm value" 값은 만들어진 프라이머가 입력된 시퀀스와 정상적으로 결합하는지 검사하기 위하여, 만들어진 프라이머와 시퀀스를 다시 PCR Analysis로 분석하게 됩니다. 이 때 만들어진 프라이머와 시퀀스가 원하는 부분 이외의 다른 부분에서 결합이 일어나는지 검사하여, 혹시라도 일어날지 모르는 실험상 오류를 검사합니다. 이 때 검사할 결합 점수를 주어줍니다. "Check restriction enzymes" 옵션은 만들어진 프라이머로 PCR을 실행해 만들어질 PCR Product를 주어진 제한효소로 제한효소분석을 수행해 제한 효소에 의해 제대로 클로닝이 안 되는 오류를 방지하기 위한 경고 옵션입니다. 사용 가능한 제한효소는 EnCyclon에서 사용되는 제한효소 리스트를 참고하십시오.

"Map Display Options"에는 결과 출력에 관한 옵션들이 있습니다. "Single or Double strand DNA display"는 Map 출력할 때 입력된 DNA 시퀀스를 Strand를 Single로 표현할 것인지 Double Strand로 표현할 것인지 설정하는 옵션이고, Display sequence width 옵션으로 Map의 출력 폭을 조정합니다. Display Translation 옵션은 증폭시키고자 하는 부분의 Amino Sequence를 함께 출력하도록 하는 옵션입니다.