프라이머 만드는 순서

1. 여기 를 클릭하여 PrimerDesigner 페이지를 여십시오.

2. GFP cDNA 시퀀스를 시퀀스 입력창에 입력합니다.

   시퀀스를 입력하는 방법은 여러 가지가 있습니다. 여기에서는 Sequence Loader를 이용하여 GENBANK에서 인터넷을 통해서 입력하겠습니다.

   1. Load Sequence 버튼을 클릭하여 Sequence Loader를 호출합니다.

   2. GFP cDNA의 GENBANK Accession을 알고 있으므로, GENBANK Accession으로 시퀀스를 로드하기 위하여 콤보박스에서 GENBANK Accession을 선택하십시오.

   3. 옆의 텍스트 박스에 GFP cDNA의 GENBANK Accession "M62653"을 입력하십시오.

   4. 바로 옆의 "Load" 버튼을 클릭하십시오.

   5. 시퀀스가 시퀀스 입력박스에 들어갔을 것입니다.

   시퀀스를 입력하는 다른 방법은 EnCyclon 사용자 안내서의 "시퀀스 입력하는 방법"을 참조하십시오.

3. 링커를 입력합니다.(선택사항)

   만들어진 프라이머와 입력한 시퀀스가 PCR 반응을 시켰을 때 만들어지는 시퀀스가 HindIII, EcoRI 제한효소 사이트를 가지도록 하기 위하여 HindIII, EcoRI의 인식 시퀀스를 입력합니다.

   • 5' Forward 프라이머 링커: GGG AAG CTT(HindIII 제한효소 사이트)

   • 3' Reverse 프라이머 링커: GGG AAG CTT(EcoRI 제한효소 사이트)

   
   
   

4. 분석 옵션을 선택합니다.

   "Design Option"에 기본값으로 "Full Length"가 선택되어있을 것입니다. 그러나 여기에서는 정확하게 GFP CDS 영역만을 PCR하는 프라이머를 디자인하기 원하기 때문에 Longest ORF를 선택합니다. 이 옵션은 시퀀스에서 ORF 영역을 찾아 그 중 가장 긴 영역을 PCR합니다.

   다른 옵션은 기본값으로 두십시오.

5. " O K " 버튼을 클릭하여 프로그램을 수행시키십시오.

6. 프로그램 수행 결과

   Warning:Your sequence is SINGLE stranded, restriction enzyme can analyze only DOUBLE strand. Set seqeunce to DOUBLE strand (1) M62653 966 base pair, Enzymes checked: ApaI, BamHI, BglII, ClaI, EcoRI, HindIII, HpaI, KpnI, MluI, NcoI, NdeI, NheI, NotI, PacI, PstI, PvuII, SacI, SalI, SpeI, XbaI, XhoI (2) Primer Table (3) Forward Primer HindIII/M62653-F HindIII, M62653, 24 bp annealing with Tm=56, Forward primer, 33 mer GGG AAG CTT ATG AGT AAA GGA GAA GAA CTT TTC Reverse Primer (4) HindIII/M62653-R HindIII, M62653, 24 bp annealing with Tm=56, Reverse primer, 33 mer GGG AAG CTT TTA TTT GTA TAG TTC ATC CAT GCC Enzyme Site Check Table (5) Enzyme # Sequence Positions HpaI 1 GTT/AAC 490 NcoI 1 C/CATGG 167 NdeI 1 CA/TATG 231 PvuII 1 CAG/CTG 677 PCR Analysis Map with Tm value 24 GGGAAGCTTATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC (A) |||||||||||||||||||||||| tacacacgaataaaagataacaaagatgagtaaaggagaagaacttttcactggagttgt 60 cccaattcttgttgaattagatggtgatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggaga 120 gggtgaaggtgatgcaacatacggaaaacttacccttaaatttatttgcactactggaaa 180 actacctgttccatggccaacacttgtcactactttctcttatggtgttcaatgcttttc 240 GGGAAGCTTTTATTTGTATAGTTCATCCATGCC (B) ||||||| aagatacccagatcatatgaaacagcatgactttttcaagagtgccatgcccgaaggtta 300 tgtacaggaaagaactatatttttcaaagatgacgggaactacaagacacgtgctgaagt 360 caagtttgaaggtgatacccttgttaatagaatcgagttaaaaggtattgattttaaaga 420 agatggaaacattcttggacacaaattggaatacaactataactcacacaatgtatacat 480 catggcagacaaacaaaagaatggaatcaaagttaacttcaaaattagacacaacattga 540 agatggaagcgttcaactagcagaccattatcaacaaaatactccaattggcgatggccc 600 tgtccttttaccagacaaccattacctgtccacacaatctgccctttcgaaagatcccaa 660 cgaaaagagagaccacatggtccttcttgagtttgtaacagctgctgggattacacatgg 720 || CC catggatgaactatacaaataaatgtccagacttccaattgacactaaagtgtccgaaca 780 ||||||||||||||||||||||| GTACCTACTTGATATGTTTATTTTCGAAGGG (B) attactaaaatctcagggttcctggttaaattcaggctgagatattatttatatatttat 840 agattcattaaaattgtatgaataatttattgatgttattgatagaggttattttcttat 900 taaacaggctacttggagtgtattcttaattctatattaattacaatttgatttgacttg 960 ctcaaa 966 PCR Product with Tm value 54 (6) NG1.0 NoID linear dsDNA 735 bp DESCRIPTION 735 bp, PCR Product of M62653 Aequorea victoria green-fluorescent protein mRNA, complete cds. FEATURE Source 10..727 F Genbank:M62653 Source 1..33 F NoID Source 703..735 R NoID CDS 10..726 F GFP ENDS 0..0 SEQUENCE 1 GGGAAGCTTA TGAGTAAAGG AGAAGAACTT TTCactggag ttgtcccaat tcttgttgaa 61 ttagatggtg atgttaatgg gcacaaattt tctgtcagtg gagagggtga aggtgatgca 121 acatacggaa aacttaccct taaatttatt tgcactactg gaaaactacc tgttccatgg 181 ccaacacttg tcactacttt ctcttatggt gttcaatgct tttcaagata cccagatcat 241 atgaaacagc atgacttttt caagagtgcc atgcccgaag gttatgtaca ggaaagaact 301 atatttttca aagatgacgg gaactacaag acacgtgctg aagtcaagtt tgaaggtgat 361 acccttgtta atagaatcga gttaaaaggt attgatttta aagaagatgg aaacattctt 421 ggacacaaat tggaatacaa ctataactca cacaatgtat acatcatggc agacaaacaa 481 aagaatggaa tcaaagttaa cttcaaaatt agacacaaca ttgaagatgg aagcgttcaa 541 ctagcagacc attatcaaca aaatactcca attggcgatg gccctgtcct tttaccagac 601 aaccattacc tgtccacaca atctgccctt tcgaaagatc ccaacgaaaa gagagaccac 661 atggtccttc ttgagtttgt aacagctgct gggattacac atGGCATGGA TGAACTATAC 721 AAATAAAAGC TTCCC //

   (1)

   PrimerDesigner는 Double Strand 시퀀스를 대상으로 하는 프로그램입니다. 입력 시퀀스가 single strand면 double strand로 변환하여 작업합니다.

   (2)

   입력한 시퀀스의 ID와 만들어진 시퀀스를 검사한 제한효소 리스트

   (3)

   만들어진 Forward Primer

   (4)

   만들어진 Reverse Primer

   (6)

   만들어진 프라이머와 입력 시퀀스의 PCR 결과(PCRCycler의 기본옵션으로 수행됨)

PCR 순서

1. 여기 를 클릭하여 PCRCycler 페이지를 여십시오.

2. GFP cDNA 시퀀스를 시퀀스 입력창에 입력합니다. GFP cDNA는 PrimerDesigner에서 이미 입력하여 프로그램을 수행하였기 때문에 WorkBench에 시퀀스가 저장되어 있습니다. 여기에 저장된 시퀀스를 호출하겠습니다.

   Tip: EnCyclon은 한 번 입력한 시퀀스는 다음에 사용이 가능하도록 분석 결과와 함께 시퀀스도 같이 WorkBench에 저장합니다. 저장된 시퀀스는 Sequence Loader를 이용해 다시 불러올 수 있으며, WorkBench를 이용하여 시퀀스를 편집, 프로그램 수행결과 보기, Plasmid Map 보기가 가능합니다. 자세한 내용은 EnCyclon 사용자 안내서의 "WorkBench 사용하기"를 참고하십시오.

   1. Load Sequence를 클릭하여 Sequence Loader를 호출합니다.

   2. WorkBenck 콤보박스를 선택하면 GFP cDNA의 시퀀스 ID와 길이를 표시한 항목이 있습니다. 선택하십시오. 그리고 옆에 Load 버튼을 클릭하십시오.

   3. 시퀀스가 시퀀스 입력박스에 들어갔을 것입니다.

3. 프라이머를 입력합니다.

   이전 과정에서 PrimerDesigner가 만들어낸 프라이머를 입력하십시오. Forward Primer를 Primer A에 Reverse Primer를 Primer B입력하십시오.

   Tip: PrimerDesigner가 만들어낸 프라이머를 기록해 놓지 않으셨다면, 다시 PrimerDesigner를 다시 수행하지 않고 프라이머를 검색하는 방법이 있습니다. WorkBench에는 이전에 수행한 시퀀스 및 결과가 저장됩니다. WorkBench를 열어 시퀀스를 선택한 후 이전에 수행한 결과를 선택하여 PrimerDesigner 만들어낸 프라이머를 찾을 있습니다.

4. 옵션을 선택합니다.

5. " O K " 버튼을 클릭하여 프로그램을 수행시키십시오.

인서트 시퀀스 DNA Cut 순서

1. 여기를 클릭하여 DNACutter 페이지를 여십시오.

2. "Enzymes" 입력 텍스트 박스에 제한효소 이름 HindIII, EcoRI를 입력합니다.

3. GFP cDNA에 HindIII, EcoRI의 제한효소 인식 시퀀스를 링커로 추가한 인서트 시퀀스를 입력합니다.

   이전 장의 튜토리얼에서부터 계속 따라하셨다면 WorkBench에 이전 장에서 만든 시퀀스가 있을 것입니다. 여기서는 WorkBench에서 저장된 시퀀스를 불러들이겠습니다. 만일 그렇지 않다면 여기를 클릭하여 시퀀스를 복사하여 시퀀스 입력박스에 붙이십시오.

   1. "Load Sequence"버튼을 클릭하여 Sequence Loader를 엽니다.

   2. 이전에 입력했던 시퀀스를 불러들이기 위해서 WorkBench 콤보박스에서 시퀀스를 선택합니다.

   3. 콤보박스 옆에 있는 "Load" 버튼을 클릭하십시오.

4. " O K " 버튼을 클릭하여 프로그램을 수행시키십시오

   프로그램을 실행시키면 다음과 같은 결과가 나옵니다.

   NoID Linear DNA, 735 base pair 2 restriction enzymes selected, Max Cut=Unlimited Fragment # Length 1 727 HindIII..HindIII (5..728) 2 8 //..HindIII (1..5) 3 8 HindIII..// (728..736) NG1.0 NoID linear dsDNA 727 bp DESCRIPTION 735 bp, PCR Product of M62653 Aequorea victoria green-fluorescent protein mRNA, complete cds. 727bp, (HindIII, HindIII) Restriction fragments of NoID FEATURE Source 6..723 F Genbank:M62653 Source 1..29 F PrimerA Source 699..727 R PrimerB Source 1..727 F NoID CDS 6..722 F GFP ENDS +4..+4 SEQUENCE 1 AGCTTATGAG TAAAGGAGAA GAACTTTTCa ctggagttgt cccaattctt gttgaattag 61 atggtgatgt taatgggcac aaattttctg tcagtggaga gggtgaaggt gatgcaacat 121 acggaaaact tacccttaaa tttatttgca ctactggaaa actacctgtt ccatggccaa 181 cacttgtcac tactttctct tatggtgttc aatgcttttc aagataccca gatcatatga 241 aacagcatga ctttttcaag agtgccatgc ccgaaggtta tgtacaggaa agaactatat 301 ttttcaaaga tgacgggaac tacaagacac gtgctgaagt caagtttgaa ggtgataccc 361 ttgttaatag aatcgagtta aaaggtattg attttaaaga agatggaaac attcttggac 421 acaaattgga atacaactat aactcacaca atgtatacat catggcagac aaacaaaaga 481 atggaatcaa agttaacttc aaaattagac acaacattga agatggaagc gttcaactag 541 cagaccatta tcaacaaaat actccaattg gcgatggccc tgtcctttta ccagacaacc 601 attacctgtc cacacaatct gccctttcga aagatcccaa cgaaaagaga gaccacatgg 661 tccttcttga gtttgtaaca gctgctggga ttacacatGG CATGGATGAA CTATACAAAT 721 AAAAGCT // NG1.0 NoID linear dsDNA 8 bp DESCRIPTION 735 bp, PCR Product of M62653 Aequorea victoria green-fluorescent protein mRNA, complete cds. 8bp, (HindIII) Restriction fragments of NoID FEATURE Source 1..8 F PrimerA Source 1..8 F NoID ENDS 0..+4 SEQUENCE 1 GGGAAGCT // NG1.0 NoID linear dsDNA 8 bp DESCRIPTION 735 bp, PCR Product of M62653 Aequorea victoria green-fluorescent protein mRNA, complete cds. 8bp, (HindIII) Restriction fragments of NoID FEATURE Source 1..8 R PrimerB Source 1..8 F NoID ENDS +4..0 SEQUENCE 1 AGCTTCCC //

   출력되는 시퀀스는 시퀀스의 길이 순으로 출력됩니다.

5. 가장 처음 나오는 시퀀스에 우리가 원하는 GFP CDS가 있을 것을 확인할 수 있습니다. 이 시퀀스 앞에 있는 체크박스를 체크하고 "Add selected sequence to WorkBench"를 클릭하여 WorkBench에 넣습니다.

   Tip: DNACutter의 결과의 Fragment List와 이후에 출력되는 시퀀스는 링크로 연결되어 있습니다. Fragment List에서 시퀀스를 클릭하시면 시퀀스 내용으로 바로 이동합니다.

   
   
   

벡터 시퀀스 DNA Cut 순서

1. "Enzymes" 입력 텍스트 박스에 제한효소 이름 HindIII, EcoRI를 입력합니다.

2. pUC19 시퀀스를 시퀀스 입력 박스에 입력합니다.

   pUC19(GenBank:L09137)를 Sequence Loader를 이용하여 GENBANK에서 불러오도록 하겠습니다.

   1. "Load Sequence"버튼을 클릭하여 Sequence Loader를 엽니다.

   2. 입력하려는 pUC19c의 GENBANK Accession을 알고 있기 때문에 GENBANK Accession 콤보박스를 선택하고 바로 옆의 텍스트 박스에 pUC19c의 Accession "L09137"을 입력합니다.

   3. 콤보박스 옆에 있는 "Load" 버튼을 클릭하십시오.

3. " O K " 버튼을 클릭하여 프로그램을 수행시키십시오. 프로그램을 실행시키면 다음과 같은 결과가 나옵니다.

   L09137 Circular DNA, 2686 base pair 2 restriction enzymes selected, Max Cut=Unlimited Fragment # Length 1 2639 HindIII..EcoRI (448..397) 2 55 EcoRI..HindIII (397..448) NG1.0 NoID linear dsDNA 2639 bp DESCRIPTION Cloning vector pUC19c, complete sequence. 2639bp, (HindIII, EcoRI) Restriction fragments of L09137 FEATURE Source 1..2639 F Genbank:L09137 Other 2240 F SPM ENDS +4..+4 SEQUENCE 1 agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt 61 ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc 121 taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc 181 cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct 241 tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 301 gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac 361 atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 421 ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 481 cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 541 tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 601 gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 661 aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 721 tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 781 aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 841 aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 901 ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 961 ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 1021 atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 1081 atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa 1141 tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag 1201 gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg 1261 tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga 1321 gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag 1381 cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa 1441 gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc 1501 atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca 1561 aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg 1621 atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat 1681 aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc 1741 aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg 1801 gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg 1861 gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt 1921 gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca 1981 ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata 2041 ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac 2101 atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa 2161 gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt 2221 atcacgaggc cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg 2281 cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt 2341 cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag 2401 cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 2461 aaataccgca tcaggcgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg 2521 gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta 2581 agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgaatt // NG1.0 NoID linear dsDNA 55 bp DESCRIPTION Cloning vector pUC19c, complete sequence. 55bp, (EcoRI, HindIII) Restriction fragments of L09137 FEATURE Source 1..55 F L09137 ENDS +4..+4 SEQUENCE 1 aattcgagct cggtacccgg ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc aagct //

4. 인서트 시퀀스와 마찬가지로 가장 큰 시퀀스 조각을 선택하고 "Add selected sequence to WorkBench"를 클릭하여 WorkBench에 넣습니다.

Ligation 순서

1. 여기를 클릭하여 A-Ligator 페이지를 여십시오.

2. "Ligation Product ID"에 라이게이션한 시퀀스의 ID를 입력하십시오

   여기서는 pUC19와 GFP를 클로닝 하였으므로 "pUC19_GFP"로 입력하겠습니다.

3. 벡터시퀀스를 입력하십시오

   pUC19c 시퀀스를 HindIII, EcoRI으로 Cut한 시퀀스로 Sequence Loader에서 "NoID;2639"로 표시된 시퀀스입니다.

4. 인서트 시퀀스를 입력하십시오

   GFP cDNA를 PCR한 시퀀스를 HindIII, EcoRI으로 Cut한 시퀀스로 Sequence Loader에서 "NoID;727"로 표시된 시퀀스입니다.

5. " O K " 버튼을 클릭하여 프로그램을 수행시키십시오

   프로그램을 실행시키면 다음과 같은 결과가 나옵니다.

   NG1.0 pUC19_GFP circular dsDNA 3358 bp DESCRIPTION Ligation product of vector NoID (2639bp) and insert NoID(727bp) Synthetic construct pUC19c cloning vector sequence. Yanisch-Perron,C., Vieira,J. and Messing,J. (1985) Gene 33 (1), 103-119 (1985) 2639bp, (HindIII, EcoRI) Restriction fragments of Genbank:X02514 FEATURE Source 1120..400 F Genbank:X02514 Source 1120..400 F NoID Source 402..1118 R Genbank:M62653 Source 1096..1123 R PrimerA Source 397..424 F PrimerB Source 397..1123 R Genbank:NoID Source 397..1123 R NoID CDS 2298..3158 R AmpR CDS 402..1118 R GFP Promoter 1127..1354 R Lac_promoter Promoter 3193 R AmpR_promoter Other 1539..2072 R Ori ENDS 0..0 SEQUENCE 1 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 61 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 121 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 181 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 241 attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 301 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 361 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt CTTATTTGTA TAGTTCATCC 421 ATGCcatgtg taatcccagc agctgttaca aactcaagaa ggaccatgtg gtctctcttt 481 tcgttgggat ctttcgaaag ggcagattgt gtggacaggt aatggttgtc tggtaaaagg 541 acagggccat cgccaattgg agtattttgt tgataatggt ctgctagttg aacgcttcca 601 tcttcaatgt tgtgtctaat tttgaagtta actttgattc cattcttttg tttgtctgcc 661 atgatgtata cattgtgtga gttatagttg tattccaatt tgtgtccaag aatgtttcca 721 tcttctttaa aatcaatacc ttttaactcg attctattaa caagggtatc accttcaaac 781 ttgacttcag cacgtgtctt gtagttcccg tcatctttga aaaatatagt tctttcctgt 841 acataacctt cgggcatggc actcttgaaa aagtcatgct gtttcatatg atctgggtat 901 cttgaaaagc attgaacacc ataagagaaa gtagtgacaa gtgttggcca tggaacaggt 961 agttttccag tagtgcaaat aaatttaagg gtaagttttc cgtatgttgc atcaccttca 1021 ccctctccac tgacagaaaa tttgtgccca ttaacatcac catctaattc aacaagaatt 1081 gggacaactc cagtgAAAAG TTCTTCTCCT TTACTCATAa gcttggcgta atcatggtca 1141 tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga 1201 agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg 1261 cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc 1321 caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac 1381 tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 1441 cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 1501 aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 1561 gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 1621 agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 1681 cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca 1741 cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 1801 ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 1861 gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 1921 tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg 1981 acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 2041 tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 2101 attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 2161 gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc 2221 ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag 2281 taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 2341 ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag 2401 ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 2461 gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact 2521 ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 2581 gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 2641 tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 2701 atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 2761 gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 2821 tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 2881 atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc 2941 agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 3001 ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 3061 tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 3121 aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat 3181 tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 3241 aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa 3301 accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtc //