1.클로닝하려는 유전자를 포함하고 있는 시퀀스를 입력한다. 이를 위해서 GenBank 탭을 선택하고 클로닝 하려는 GFP cDNA의 GenBank ID인 M62653를 입력한 후 "Load" 버튼을 클릭하여 시퀀스를 불러온다. 만일 유전자를 시퀀싱한 결과를 가지고 있다면 그 시퀀스를 복사해 붙인다.

2. 실험에 사용할 제한효소를 입력한다. 여기서는 HindIII와 EcoRI을 사용한다.

제한효소 이름을 직접 입력하거나, 이미 사용한 적이 있다면, 옆의 콤보박스를 이용하여 입력한다.

3. Options 버튼을 클릭하여 제한효소 분석 옵션이 보이게 한다.

4. Translation 옵션을 찾아서 제한효소 분석에 시퀀스가 단백질로 Translation이 된 결과와 같이 보이게 설정한다.

5. Go를 클릭하여 제한효소 분석을 한다.

6. 결과 분석: 아래와 같이 사용하려는 제한효소는 유전자의 Cutting Site가 없다. 이는 유전자를 클로닝하는데 Internal Cut이 나오지 않아 정상적으로 사용 가능하다는 것을 알려준다. 또 여기서 Translation이 된 영역을 보면 클로닝하려는 유전자는 유전자의 Mutation의 없고(혹 있더라도) 정상적으로 유전자가 존재한다는 것을 볼 수 있다.

Cycloner -> PrimerDesigner를 선택하여 PrimerDesigner 도구를 오픈한다.

내 워크벤치를 클릭하여 이전에 분석했던, GFP cDNA(M62653;966bp)의 시퀀스를 입력한다. 그리고 분석했던 제한효소를 프라이머의 링커로 위와같이 입력하여 Primer를 만든다. 여기서도 마찬가지로 Options를 클릭하여 Translation을 같이 출력하게 하면 정확하게 Primer가 디자인되는지 쉽게 확인할 수 있다.

원하는 프라이머가 정확하게 디자인 되어있는지 PCR Analysis Map을 보면서 확인하고, 마지막의 PCR Product를 확인하여 제대로 된 PCR Product가 나왔는지 확인한다. Map에는 만들어진 Primer가 내부 annealing이 되어 PCR이 잘못될 경우가 있는지 검사하기 때문에 한번 확인하기 바란다. 확인 결과 이상이 없으면 Primer Table에서 Primer를 클릭하여 내 워크벤치에 프라이머를 저장하고, 프라이머를 주문한다.

주문한 프라이머가 배달되면, 유전자를 클로닝하고, 클로닝된 사이즈를 전기영동으로 확인하여 실험이 문제없는지 확인한다. 클로닝한 시퀀스를 시퀀싱하고 Map을 그려 실험을 정리하면 된다.

클로닝된 유전자의 시퀀싱 결과가 오면 각 시퀀스 조각들을 EMBOSS/Merger 이용하여 하나의 시퀀스로 Merge한 후 그 결과를 PlasmidMap을 이용하여 그림을 그리면 다음과 같은 PlasmidMap이 나온다.